動(dòng)物外周血白細(xì)胞分離液實(shí)驗(yàn)方法
“XXXX”動(dòng)物外周血白細(xì)胞分離液實(shí)驗(yàn)方法
（細(xì)胞培養(yǎng)及分子生物學(xué)）
【產(chǎn)品規(guī)格】
200ml/Kit
【產(chǎn)品組成】
為方便廣大用戶(hù)使用，試劑內(nèi)容如下：
|
|
| 名稱(chēng) | 產(chǎn)品編號(hào) |
| 規(guī)格 |
| ||
| A | XXXX 動(dòng)物外周血白細(xì)胞分離液 |
|
|
| 200ml |
| ||
| B | 樣本稀釋液（贈(zèng)品） | 2010C1119 |
| 200ml |
| |||
| C | 清洗液（贈(zèng)品） |
|
| 2010X1118 |
| 200ml |
| |
| D | 紅細(xì)胞裂解液（贈(zèng)品） | NH4CL2009 |
| 100ml |
| |||
| E | 說(shuō)明書(shū) |
|
|
|
|
| 1 份 |
|
【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】 |
|
|
|
|
|
|
| ||
A． 適用儀器 |
|
|
|
|
|
|
| ||
| zui大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī) |
|
|
|
|
| |||
B． 耗材 |
|
|
|
|
|
|
|
| |
| 產(chǎn)品名稱(chēng) |
| 產(chǎn)品貨號(hào) |
| 產(chǎn)地 |
|
| ||
| 15ml 離心管散裝 |
| 339650 |
| 美國(guó) NUNC |
|
| ||
| 15ml 離心管架裝 |
| 339651 |
| 美國(guó) NUNC |
|
| ||
| 50ml 離心管散裝 |
| 339652 |
| 美國(guó) NUNC |
|
| ||
| 50ml 離心管架裝 |
| 339653 |
| 美國(guó) NUNC |
|
| ||
無(wú)菌膠頭滴管或塑料滴管
【檢驗(yàn)方法】
全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。
首先取抗凝血，根據(jù)樣本量大小，分以下兩種情況：
情況 A：血液樣本量小于 5ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
1.取一支 15ml 離心管，先加入 5ml 分離液
2.用吸管小心吸取血液樣本加于分離液液面上，400-500g，離心 20-30min（注：如改變血液樣本及分離液用量，需相應(yīng)調(diào)整離心力及離心時(shí)間，具體離心條件需客戶(hù)自行摸索，以達(dá)到*分離效果。）
3.離心后用吸管小心吸取所有環(huán)狀乳白色細(xì)胞層（一層或兩層），加入 10 ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。250g，離心 10min。重復(fù)洗滌 2-3 次，即得所需白細(xì)胞。
4.如有紅細(xì)胞殘留請(qǐng)使用紅細(xì)胞裂解液（產(chǎn)品編號(hào)：NH4CL2009）裂解紅細(xì)胞，具體操作方法詳見(jiàn)“紅細(xì)胞裂解液使用說(shuō)明”。
情況 B：血液樣本量大于等于 5ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
1.取一支適當(dāng)?shù)碾x心管，先加入與樣本等量的分離液。
2.將血液樣本小心加于分離液之液面上，450-650g（zui大離心力可至 1000g），離心20-30min。（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件需客戶(hù)自行摸索，以達(dá)到*分離效果。加入血液樣本后，樣本及分離液總體積不得超過(guò)離心管總體積的三分之二）。
3.剩余步驟同“情況 A”中步驟 3 與步驟 4。
【注意事項(xiàng)】
1.全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得*的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，血液存放時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞分離效果越差。血液放置超過(guò) 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。
2.本實(shí)驗(yàn)不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無(wú)靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過(guò)后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會(huì)變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。
3.分離液用量大于稀釋后血液樣本時(shí)，分離效果更佳。
4.當(dāng)血液樣本粘度過(guò)高需稀釋時(shí)，*稀釋方法：將血液與樣本稀釋液（產(chǎn)品編號(hào)：2010C1119）1:1 稀釋混勻備用。注：不當(dāng)?shù)南♂尫椒〞?huì)降低細(xì)胞得率及活性。如血液樣本經(jīng)過(guò)稀釋則分離過(guò)程中需適當(dāng)降低離心力和離心時(shí)間。
5.如實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過(guò)低，請(qǐng)?zhí)旖驗(yàn)笠詫で髱椭?，具體詳見(jiàn)下方生產(chǎn)企業(yè)信息。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
18-25℃保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無(wú)菌條件操作。無(wú)菌條件下操作，啟封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】
本實(shí)驗(yàn)白細(xì)胞提取率及純度大于 80%。
下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶(hù)可適當(dāng)進(jìn)行參考。
| 紅細(xì)胞 |
| 白細(xì)胞 |
| 血小板 |
|
| （4.0-10.0）×109 |
| ||
含量（個(gè)/L） | （4.0-5.5）×1012 | 中性粒細(xì)胞 | 淋巴細(xì)胞 | 單核細(xì)胞 | （1.0-3.0）×1011 |
|
| 50%-70% | 20%-40% | 3%-8% |
|
【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】
1.所獲得白細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。
2.所獲得白細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。
3.所獲得白細(xì)胞的鑒定方法A.流式細(xì)胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù)C.原位雜交技術(shù)D.PCR 技術(shù)
【可能存在的問(wèn)題及解決方法】
1.由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問(wèn)題及解決方案如下表所示：
出現(xiàn)情況 | 出現(xiàn)原因 | 建議解決方案 |
離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層 | 轉(zhuǎn)速過(guò)小或離心時(shí)間過(guò)短 | 適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速 |
離心后目的細(xì)胞存在于分離液中 | 轉(zhuǎn)速過(guò)大或離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng) | |
| ||
離心后白環(huán)層彌散 | 細(xì)胞密度過(guò)大 | 調(diào)整細(xì)胞密度 |
離心后白環(huán)層太淺或看不見(jiàn) | 細(xì)胞密度過(guò)小 | |
|
2.本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶(hù)可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，恒定離心時(shí)間，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。
3.本分離液依照標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級(jí)原料，性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類(lèi)產(chǎn)品略有不同，可能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。
注：在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到*分離效果，
離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。
