各種動物外周血樹突狀細胞分離液實驗方法
【產品規格】
2×200ml/Kit
【產品組成】
為方便廣大用戶使用，試劑內容如下：
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| 名稱 | 產品編號 |
| 規格 |
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| A | 試劑 A |
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| 200ml |
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| B | 試劑 D |
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| 200ml |
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| C | 樣本稀釋液（贈品） |
| 2010C1119 |
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| 200ml |
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| D | 清洗液（贈品） |
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| 2010X1118 |
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| 200ml |
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| E | 說明書 |
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| 1份 |
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【實驗前準備】 |
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A． 適用儀器 |
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| zui大離心力可達 1200g 的水平轉子離心機 |
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B． 耗材 |
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| 產品名稱 |
| 產品貨號 |
| 產地 |
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| 15ml離心管散裝 |
| 339650 |
| 美國NUNC |
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| 15ml離心管架裝 |
| 339651 |
| 美國NUNC |
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| 15ml離心管散裝 |
| 339652 |
| 美國NUNC |
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| 50ml離心管架裝 |
| 339653 |
| 美國NUNC |
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| 無菌膠頭滴管或塑料滴管 |
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【檢驗方法】 |
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全過程樣本、試劑及實驗環境均需在 20±2℃的條件下進行。
首先取抗凝血按體積比 1:1 的比例加樣本稀釋液（產品編號：2010C1119）混勻，根據稀釋后的樣本量大小，分以下兩種情況：
情況A：稀釋后的血液樣本量小于 5ml 時，實驗方法如下：
1. 取一支 15ml 離心管，先加入 3ml 試劑 A 后加入 2ml 試劑 D，制成梯度界面。
2. 用吸管小心吸取稀釋后的血液樣本加于分離液液面上，400-550g ，離心 20-30min（注： 根據血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到*分離效果）。
3. 離心后，此時離心管中將出現兩層環狀乳白色細胞層。
4. 用吸管小心吸取上層環狀乳白色目的細胞層到另一 15ml 離心管中，往所得離心管中 加入 10ml 清洗液（產品編號：2010X1118），混勻細胞。
5. 250g，離心 10min。
6. 棄上清。
7. 用吸管以 5-10ml 清洗液（產品編號：2010X1118）重懸所得細胞。
8. 250g，離心 10min。
9. 重復 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續實驗所需相應液體重懸細胞。
10. 差異貼壁法純化細胞 （1）用樹突狀細胞無血清培養基（產品編號：CDC2015）或樹突狀細胞*培養基（產 品編號：HCDC2015）以 1.5-3×106 個/ml 的密度重懸細胞，將細胞鋪于一次性細胞板或 細胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培養箱中進行貼壁培養。
（2）2-4 小時內貼壁的為巨噬細胞前體（俗稱為單核細胞）。 （3）10-24 小時內貼壁的單個核細胞為內皮、內皮祖細胞、干細胞。 （4）不貼壁的為淋巴細胞。
注：
a) 無血清培養基中不含任何動物成分，為得到更佳培養效果可添加 10%自體血漿或 2-8%經灝洋篩選的胎牛血清。
b) *培養基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養的目的細胞而定）。
c) 由于每種細胞的貼壁時間存在差異可將所得細胞分開已達簡單的純化目的，此法成 本相對較低。如需獲得高純度目的細胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰性分選。
情況 B：稀釋后的血液樣本量大于等于 5ml 時，實驗方法如下
1. 取一支適當的離心管，依次小心加入試劑 A、試劑 D（試劑 A 與試劑 D 體積比為 3:2， 試劑總量與稀釋后的樣本量相等），制成梯度界面。
2. 將經稀釋后的血液樣本小心加于分離液之液面上，450-650g（zui大離心力可至 1000g）， 離心 20-30min。（注：根據血液樣本量確定離心條件，血液量越多，離心力越大，離心 時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到*分離效果。加入血液樣本后，樣 本及分離液總體積不得超過離心管總體積的三分之二）。
3. 剩余步驟同“情況 A”中步驟 3 至步驟 10。
【注意事項】
1. 全過程樣本、試劑及實驗環境均需在 20±2℃的條件下進行。為獲得*的實驗結果， 在取血 2h 內進行實驗，血液存放時間越長，細胞分離效果越差。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達到分離目的。
2. 本實驗不使用高聚合材質（如聚苯乙烯）的塑料制品，應使用無靜電、低靜電離心 管及未經堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面會 變成毛面，影響細胞分離效果。
3. 吸取過多的目的細胞層及分離液層會導致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的粒細胞數量增加。
4. 吸取過多的目的細胞層上層溶液會導致血漿蛋白及血小板混雜。
5. 分離液用量大于稀釋后的血液樣本時，分離效果更佳。
6. 如實驗后細胞得率或活性過低，請TBD以尋求幫助。
【儲存條件及有效期】
18-25℃保存，有效期 2 年。本品易感染細菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現白色結晶，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】
本實驗樹突狀細胞提取率大于 80%。
【參考值（參考范圍）】
本實驗 NK 細胞提取率大于 80%。
下表為成年人外周血中各種細胞的數量及比例，用戶可適當進行參考。
| 紅細胞 |
| 白細胞 |
| 血小板 |
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| （4.0-10.0）×109 |
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含量（個/L） | （4.0-5.5）×1012 | 中性粒細胞 | 淋巴細胞 | 單核細胞 | （1.0-3.0）×1011 |
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| 50%-70% | 20%-40% | 3%-8% |
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【相關實驗技術方案】
1. 所獲得樹突狀細胞的培養技術。
2. 所獲得樹突狀細胞的核酸提取技術。
3. 所獲得樹突狀細胞的鑒定方法
A.流式細胞技術
B.免疫組化技術
C.原位雜交技術
D.PCR 技術
純化、擴增、鑒定及生物治療技術手冊”，并在說明書項目欄下下載使用。
【可能存在的問題及解決方法】
1. 由于血液粘度、細胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：
出現情況 | 出現原因 | 建議解決方案 |
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離心后目的細胞存在于血漿層或稀釋液層 | 轉速過小或離心時間過短 | 適當增減轉速 |
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離心后目的細胞存在于分離液中 | 轉速過大或離心時間過長 | |
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離心后白環層彌散 | 細胞密度過大 | 調整細胞密度 |
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離心后白環層太淺或看不見 | 細胞密度過小 | |
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2. 本分離液分離細胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關。不同地 區客戶可根據當地情況對離心條件進行適當調整。建議對離心條件進行調整時，恒定離 心時間，對離心轉速進行調整。
3. 本分離液依照標準，全部使用藥用級原料，性能指標與國產同類產品略有不同，可 能出現紅細胞沉降不*的情況，可以適當加大離心轉速。
注：在對離心條件進行調整時，離心轉速的加減以 50-100g 為基數，直至達到*分離效果，
離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min 為準。
